在農業生物技術快速發展的背景下，精準高效的分子檢測技術成為作物遺傳改良與抗病育種的關鍵支撐。

全球糧食安全面臨著作物產量提升與生物脅迫防控的雙重挑戰。傳統育種方法周期長、效率低，難以滿足現代農業對優良品種的迫切需求。分子生物學技術的進步為作物遺傳改良提供了新途徑，其中實時熒光定量PCR技術因其高特異性、高靈敏度和準確定量能力，已成為基因表達分析、分子標記篩選和病原菌檢測的核心手段。

博清生物科技（南京）有限公司作為專注于生命科學儀器研發的企業，其熒光定量PCR儀在農業生物技術領域展現出獨特優勢。該儀器融合了快速升降溫技術、多通道熒光檢測系統和便攜化設計，既滿足實驗室高通量分析需求，又可實現田間現場檢測。

一、材料與方法

（一）儀器性能參數

本研究采用博清生物熒光定量PCR儀，其核心技術參數如下：樣本容量為8×0.2mL透明PCR管，支持20-100μL反應體系；采用帕爾貼加熱制冷方式，溫度范圍4-100℃，溫度準確性±0.1℃，均一性±0.15℃；配備4個高效單色LED光源和SiPMT檢測器，激發/發射波長范圍455-650nm/510-750nm，支持FAM/SYBR Green、VIC/HEX、ROX、Cy5等常用熒光染料；儀器重量僅1.4kg，可電池供電，適用于野外現場檢測。

（二）實驗方法優化

1、核酸提取與質量控制

采用CTAB法提取作物葉片基因組DNA或總RNA，使用NanoDrop測定A260/A280比值（1.9-2.1）和濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證核酸完整性（28S/18S≥1.5）。RNA樣本經DNaseⅠ處理去除基因組DNA污染，設置無逆轉錄對照（No-RT control）驗證處理效果，要求Cq值≥35。

2、qPCR反應體系配置

優化后的20μL反應體系包含：2×TaqMan混合液10μL，上、下游引物各0.5μL（終濃度0.2-0.5μmol/L），探針 0.4μL（終濃度 0.2μmol/L），模板 DNA/cDNA 1μL（20ng/μL），ddH?O補足體積。反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性10s，60℃退火延伸35s，40個循環，在退火延伸階段收集熒光信號。

3、數據分析方法

采用2^(-ΔΔCt) 法進行基因相對表達量分析，以β-actin作為內參基因。設置3次技術重復和3次生物學重復，結果以平均值±標準差表示。使用儀器自帶軟件進行熔解曲線分析，驗證擴增產物特異性，要求單一熔解峰且無引物二聚體干擾。

二、結果與分析

（一）在作物育種中的應用

1、基因拷貝數變異分析

在芥菜葉形改良研究中，利用博清生物qPCR儀檢測BjRCO基因拷貝數變異。結果顯示，裂葉芥菜品種中BjRCO基因拷貝數顯著高于圓葉品種（P<0.01），與重測序數據的相關性達到0.96，證實該方法準確性。通過優化Mg2?濃度（2.5mM）和退火溫度（60℃），檢測變異系數（CV）降至1.2%，較傳統PCR方法靈敏度提高10倍。

2、分子標記輔助選擇

在大白菜高活力種子選育中，基于BraPYL分子標記開發的qPCR檢測體系，可快速區分高活力種子（323bp單一條帶）。博清儀器的4通道檢測能力實現了目標片段與內參基因的同步擴增，檢測時間較瓊脂糖電泳法縮短6小時，且在種子萌發早期（24h）即可準確預測活力水平。田間試驗表明，該方法篩選的高活力種子出苗率提高23%，顯著優于傳統發芽試驗。

（二）在抗病研究中的應用

1、抗病基因表達動態監測

在水稻紋枯病抗性研究中，采用博清qPCR儀分析接種后24h和48h免疫相關基因的表達變化。結果顯示，抗病品種月亮谷中WARK71和WARK53基因表達量分別上調8.3倍和6.7倍，顯著高于感病品種（P<0.05），且兩個時間點的表達差異通過高分辨率熔解曲線得到有效區分。儀器的快速升降溫功能（6℃/s）使每個反應循環時間縮短至45s，全天可完成96個樣本的8重基因檢測。

2、病原菌多重檢測體系

針對煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY），建立基于博清qPCR儀的三重檢測方法。優化后的體系檢測下限分別達到2.60×101、1.25×101和2.33×101copies/μL，批內與批間CV均<1.5%。田間樣本檢測顯示，該方法與單重PCR結果一致性達100%，但檢測效率提升3倍，且通過便攜設計實現了田間采樣后3小時內獲得檢測結果。

三、討論

博清生物qPCR儀在農業應用中的技術優勢主要體現在三個方面：其一，高靈敏度檢測能力（低至10copies/μL）使其能夠準確量化作物基因組中的低豐度變異和病原菌早期侵染信號，這對于抗病基因的精細定位至關重要；其二，多通道熒光檢測系統支持多重反應同時進行，顯著降低了育種篩選成本，如在三重病毒檢測中試劑消耗量減少60%；其三，便攜化設計突破了傳統實驗室檢測的時空限制，特別適用于偏遠地區的田間快速診斷。

與同類產品相比，博清儀器的溫度均一性（±0.15℃）確保了檢測數據的高重復性，這在基因表達譜分析中尤為重要。其獨特的光學系統設計無需頻繁校準，長期使用穩定性優于同類進口產品，年度維護成本降低約30%。在實際應用中，該儀器成功實現了從實驗室基因分型到田間抗病性驗證的全鏈條技術支持，將傳統育種中的表型選擇周期從generations 縮短至分子水平的數月。

本研究也存在一定局限性：首先，部分作物特異性標記的qPCR體系仍需進一步優化；其次，儀器的高通量檢測能力在大規模育種群體篩選中略顯不足。未來可通過開發384孔板模塊和自動化樣本處理系統加以改進。此外，結合數字PCR技術實現絕對定量，將進一步提升檢測精度，特別是在基因編輯作物的拷貝數驗證中具有應用潛力。

博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀通過整合高靈敏度檢測、多通道分析和便攜化設計三大核心技術，為作物育種與抗病研究提供了一體化解決方案。在作物遺傳改良中，該技術顯著提升了基因拷貝數變異檢測和分子標記篩選的效率；在抗病研究中，實現了抗病基因表達動態監測和病原菌快速鑒定的精準化。實踐證明，博清生物qPCR技術能夠有效縮短育種周期、提高抗病品種培育效率，對推動農業生物技術創新和精準農業發展具有重要實踐意義。未來通過與基因組編輯、大數據分析等技術的深度融合，有望在作物分子設計育種中發揮更大作用。