在現(xiàn)代分子生物學研究領(lǐng)域，核酸定量以及標準品制備是極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，它們對于確保實驗結(jié)果的可靠性與可重復性起著決定性作用。而博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀，憑借其卓越的性能，成為了這兩項重要工作的得力工具。

博清生物熒光定量PCR儀實現(xiàn)精準核酸定量

核酸定量在分子生物學實驗里占據(jù)著核心地位。無論是PCR反應、基因測序，亦或是其他各類分子生物學實驗，精確知曉樣本中核酸的濃度都是實驗成功的關(guān)鍵所在。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀在核酸定量方面，運用了先進的實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)。

其工作原理基于在PCR反應體系中巧妙加入熒光基團。在PCR反應進程中，儀器能夠持續(xù)且實時地監(jiān)測反應體系內(nèi)熒光信號的動態(tài)變化。當熒光信號增強至某一預先設定的閾值時，此時對應的循環(huán)次數(shù)，即循環(huán)閾值Ct（Cycle Threshold，Ct）便會被精準記錄下來。這里存在一個重要的線性關(guān)系，即該循環(huán)參數(shù)Ct與PCR體系中起始模板數(shù)的對數(shù)之間有著嚴格的對應關(guān)系。通過利用不同梯度的陽性定量標準模板進行擴增，獲取相應的Ct值，并將其與陽性定量標準模板數(shù)進行對數(shù)擬合繪圖，進而構(gòu)建出標準曲線。最終，依據(jù)待測樣品的Ct值，借助這條標準曲線，就能極為準確地確定起始模板的數(shù)量。

與傳統(tǒng)的核酸定量方法相比，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀優(yōu)勢顯著。以常見的紫外-可見分光光度法為例，雖然該方法操作簡單、速度快，但其嚴重缺陷在于無法有效區(qū)分DNA與RNA，并且對樣本中的雜質(zhì)較為敏感，容易導致定量結(jié)果不準確。而博清生物熒光定量PCR儀不僅能夠精準區(qū)分DNA和RNA，還具備極高的靈敏度，能夠檢測出極低濃度的核酸樣本，即便是單拷貝的DNA或RNA也能有效檢測。同時，其特異性也非常出色，使用特異性探針（如TaqMan探針）時，能夠精確區(qū)分特定基因的突變和變異，這是傳統(tǒng)方法難以企及的。

在實際應用場景中，比如在基因表達分析方面，科研人員通過博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀定量檢測不同條件下基因的表達水平，進而深入研究基因的調(diào)控機制，探究基因在響應特定刺激時的表達變化情況，以及分析基因在不同組織或發(fā)育階段的差異表達。在病原體檢測領(lǐng)域，由于該儀器的高靈敏度，能夠快速、準確地檢測樣本中極低含量的病毒、細菌或其他病原體，像新冠病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌等的檢測，為疾病的早期診斷和防控提供了有力支持。

博清生物熒光定量PCR儀助力標準品制備

標準品的制備在熒光定量PCR實驗中至關(guān)重要，它直接關(guān)系到實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀在標準品制備方面，為科研人員提供了多種行之有效的方法。

DNA標準品制備

PCR擴增片段作為標準品

通過常規(guī)PCR技術(shù)對目的靶點進行擴增，隨后對擴增得到的片段進行回收和純化處理，這些純化后的PCR擴增片段便可直接作為標準品使用。這種方法的優(yōu)勢在于操作相對簡便，易于生成標準品。然而，其不足之處在于穩(wěn)定性相對欠佳，相較于質(zhì)粒，PCR擴增片段在儲存過程中可能更容易發(fā)生降解等變化，從而影響標準品的長期使用效果。

質(zhì)粒克隆作為標準品

具體操作流程為，先將目的片段進行PCR擴增，接著回收目的條帶，并將其連接到T載體上。完成連接后，進行質(zhì)粒提取操作，通過OD值定量確定質(zhì)粒濃度，最后將質(zhì)粒進行梯度稀釋，便可作為標準品用于實驗。質(zhì)粒克隆作為標準品的優(yōu)點十分突出，它易于生成和定量，并且在適當?shù)膬Υ鏃l件下，能夠較好地維持穩(wěn)定性，為實驗提供可靠的標準參照。不過，該方法也存在一定的局限性，在用于qRT-PCR實驗時，由于無法模擬逆轉(zhuǎn)錄步驟，可能會在一定程度上影響反應效率。

RNA標準品制備

主要通過制備目的靶點的體外轉(zhuǎn)錄RNA來作為標準品。其制備過程相對復雜，首先利用實時熒光定量PCR生成的PCR產(chǎn)物，借助包含5’T7啟動子的序列和包含3’poly(T)的逆轉(zhuǎn)錄引物重新進行擴增。隨后進行體外轉(zhuǎn)錄反應，生成多聚腺苷酸化正義mRNA。對轉(zhuǎn)錄得到的mRNA進行純化處理后，將其準確定量并進行稀釋，最終用于生成標準曲線。這種RNA標準品的優(yōu)勢在于能夠結(jié)合RT效率，最大程度地模擬目的靶點在實際反應中的狀態(tài)。但不可避免的是，該方法需要耗費大量的時間和精力來生成標準品，并且由于RNA本身的不穩(wěn)定性，使得其難以長期保持高度的準確性，對儲存條件和使用期限都有較為嚴格的要求。

在制備標準品時，需要嚴格遵循一系列注意事項，以確保標準品的質(zhì)量。模板的選擇和處理至關(guān)重要，要盡可能保證模板的純度，避免其受到污染或降解。引物的設計應遵循嚴格的原則，引物長度一般以15-30個堿基為宜，上下游引物的長度差別不宜大于3個堿基。引物的（G+C）含量應控制在40%-60%，且4種堿基在引物中應均勻分配。引物自身不能存在互補序列，尤其不能有大于3bp的反向重復序列，否則容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響引物與模板的結(jié)合。上下游引物之間也不應有過多的互補或同源堿基，特別是要避免3’端的互補重疊，以防形成引物二聚體。引物的3’端不能進行任何修飾，且不能有形成二級結(jié)構(gòu)的可能性，3’端堿基盡量避免選用T。而引物的5’端則可以根據(jù)實驗需求進行適當修飾。同時，還需通過預實驗確定引物的最適濃度，一般濃度范圍在0.2-1.0μmol/l。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀在分子生物學的核酸定量與標準品制備工作中展現(xiàn)出了強大的功能和顯著的優(yōu)勢。它為科研人員提供了精準、可靠的實驗手段，有力地推動了分子生物學領(lǐng)域的研究進展，在基因表達分析、病原體檢測、基因突變檢測等眾多研究方向上都發(fā)揮著不可或缺的重要作用，成為現(xiàn)代分子生物學實驗室的必備儀器之一。