在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)核酸分子進(jìn)行精準(zhǔn)定量分析是眾多研究和臨床診斷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀憑借其獨(dú)特的技術(shù)原理，成為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的核心工具。下面，將從基礎(chǔ)技術(shù)到實(shí)現(xiàn)方式，全方位解析熒光定量PCR儀的工作原理。

一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：定量分析的基石

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是熒光定量PCR儀運(yùn)行的基礎(chǔ)，它能在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，實(shí)現(xiàn)特定DNA片段的快速擴(kuò)增。PCR反應(yīng)以溫度變化為驅(qū)動(dòng)，通過(guò)不斷循環(huán)“變性-退火-延伸”三個(gè)步驟，使目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。

在變性階段，反應(yīng)體系被加熱至約95℃，高溫破壞DNA雙鏈間的氫鍵，使雙鏈DNA解旋成為兩條單鏈，為后續(xù)引物結(jié)合和新鏈合成提供模板。退火過(guò)程中，溫度降至55-65℃，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)的特異性引物，憑借堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與單鏈DNA模板的特定區(qū)域結(jié)合。最后，當(dāng)溫度上升到72℃左右，DNA聚合酶發(fā)揮作用，以四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）為原料，從引物的3’端開(kāi)始，沿著模板DNA鏈合成新的互補(bǔ)DNA鏈，完成一次PCR循環(huán)。隨著循環(huán)次數(shù)增加，目的DNA片段數(shù)量以2?（n為循環(huán)次數(shù)）的速度增長(zhǎng)，原本極微量的目標(biāo)DNA可被擴(kuò)增至上百萬(wàn)倍，從而便于后續(xù)檢測(cè)分析。

二、熒光定量技術(shù)：實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，引入熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量分析。目前，常用的熒光定量方法主要有熒光染料法和熒光探針?lè)ǎ邚牟煌瑱C(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)。

（一）熒光染料法

SYBR Green是熒光染料法中最具代表性的熒光染料，它能夠非特異性地與雙鏈DNA的小溝區(qū)域結(jié)合。在PCR反應(yīng)開(kāi)始前，SYBR Green處于游離狀態(tài)，幾乎不發(fā)出熒光。隨著PCR擴(kuò)增進(jìn)行，雙鏈DNA產(chǎn)物不斷生成，SYBR Green染料分子嵌入雙鏈DNA小溝，形成染料-DNA復(fù)合物，該復(fù)合物在激發(fā)光作用下可發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量成正比。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，就能直觀反映PCR反應(yīng)進(jìn)程中產(chǎn)物的積累情況。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可推算出樣品中初始模板DNA的含量。這種方法操作簡(jiǎn)便、成本較低，適用于對(duì)多種DNA模板的快速定量檢測(cè)，但由于其對(duì)所有雙鏈DNA均有結(jié)合作用，容易受到引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。

（二）熒光探針?lè)?/span>

以TaqMan探針為代表的熒光探針?lè)ǎ瑢?shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA片段的特異性檢測(cè)。TaqMan探針是一段長(zhǎng)度為18-24個(gè)堿基的寡核苷酸序列，其5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)（如FAM），3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（如TAMRA）。在PCR反應(yīng)體系中，當(dāng)探針保持完整時(shí)，由于報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離較近，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)法檢測(cè)到熒光。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)引物與模板結(jié)合并開(kāi)始延伸時(shí)，Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性發(fā)揮作用，將與模板互補(bǔ)結(jié)合的TaqMan探針逐步酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離。此時(shí)，報(bào)告基團(tuán)不再受淬滅基團(tuán)的影響，在激發(fā)光照射下能夠發(fā)射出可被檢測(cè)系統(tǒng)捕捉的熒光信號(hào)。隨著PCR產(chǎn)物不斷增加，被切割的探針數(shù)量增多，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量分析。這種方法特異性強(qiáng)，可有效避免非特異性擴(kuò)增的干擾，尤其適用于復(fù)雜樣本中低豐度目標(biāo)基因的檢測(cè)，但探針設(shè)計(jì)和合成成本相對(duì)較高。

三、熒光定量PCR儀的硬件支撐

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀的精準(zhǔn)工作離不開(kāi)其精密的硬件系統(tǒng)，主要包括熱循環(huán)系統(tǒng)和熒光檢測(cè)系統(tǒng)。熱循環(huán)系統(tǒng)負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)所需的溫度循環(huán)，多采用半導(dǎo)體加熱制冷技術(shù)，可快速、精準(zhǔn)地控制反應(yīng)溫度，確保每個(gè)循環(huán)中變性、退火、延伸步驟的溫度條件穩(wěn)定，為PCR反應(yīng)提供可靠的環(huán)境。熒光檢測(cè)系統(tǒng)則是實(shí)現(xiàn)熒光定量的核心，由熒光激發(fā)部件、光信號(hào)傳輸部件、熒光檢測(cè)部件和控制系統(tǒng)組成。熒光激發(fā)部件通常采用穩(wěn)定的LED光源，為熒光物質(zhì)提供激發(fā)光；光信號(hào)傳輸部件利用耐高溫的導(dǎo)光光纖，高效傳輸熒光信號(hào)；熒光檢測(cè)部件配備高靈敏度的光電傳感器，能夠精準(zhǔn)捕捉微弱的熒光信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再經(jīng)控制系統(tǒng)處理后，以數(shù)據(jù)形式呈現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)對(duì) PCR 反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與記錄。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的熒光定量PCR儀通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的擴(kuò)增，借助熒光染料法或熒光探針?lè)▽?shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)，再依靠精密的硬件系統(tǒng)確保反應(yīng)和檢測(cè)的準(zhǔn)確性，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸樣本的精準(zhǔn)定量分析，為生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷提供了強(qiáng)大且可靠的技術(shù)支持。